Analiza clinica, moleculara si citogenetica a 46, XX tulburare testiculara a dezvoltarii sexului cu SR–pozitiv

fundal

Pentru a trece in revista posibilele mecanisme propuse pentru a explica etiologia inversarii sexului 46, XX, prin investigarea caracteristicilor clinice si a relatiilor lor cu cariotipul cromozomial si gena SRY (regiunea determinanta a sexului Y).

metode

Cinci pacienti netratati 46, XX cu SRY- pozitiv au fost referiti pentru infertilitate. Datele clinice au fost colectate si s-a efectuat analiza cariotipului de banda G in limfocite si hibridizare cu fluorescenta in situ (FISH). A fost extras ADN-ul genomic din sangele periferic al pacientilor care folosesc QIAamp DNA Kits Blood. Cele trei regiuni discrete, AZFa, AZFb si AZFc, localizate pe bratul lung al cromozomului Y, au fost realizate prin amplificare PCRs multiplex (Polimeraza Chain Reaction). Setul de primeri PCR pentru diagnosticul microdeletiei regiunii AZFa, AZFb si AZFc au inclus: sY84, sY86, sY127, sY134, sY254, sY255, SRY si ZFX / ZFY.

Rezultate

Cei cinci pacienti ai nostri au avut o inaltime mai mica a corpului. Examinarea fizica a relevat faptul ca testiculele lor au un volum mic, au o textura moale si un penis normal. Analizele semenului au aratat azoospermie. Toti pacientii au avut un hormon de stimulare mai mare a foliculilor (FSH), hormon luteinizant (LH), testosteron liber mai scazut, nivel de testosteron si nivel normal de Estradiol, Prolactina. Analiza cariotipului la toti pacientii a confirmat 46, XX cariotip si analiza FISH a aratat ca gena SRY a fost pozitiva si translocata la Xp. Analiza moleculara a relevat faptul ca gena SRY a fost prezenta, iar regiunile AZFa, AZFb si AZFc au fost absente.

concluzii

Acest studiu adauga cazuri la cele cinci noi persoane de sex masculin 46, XX cu SRY -pozitional si verifica in continuare opinia ca prezenta genei SRY si absenta regiunilor majore in cromozomul Y ar trebui sa conduca la asteptarea unui fenotip complet masculinizat, hormon anormal niveluri si infertilitate.

Tulburarea 46, XX a dezvoltarii sexului (DSD) este o forma rara de inversare a sexului la barbatii infertili, aceasta a fost descrisa prima data de La Chapelle si colab. in 1964 si a avut loc 1: 20000 la subiecti nou-nascuti [1]. Pana in 1996, 150 de pacienti cu sindrom XX masculin clasic au fost raportati si peste 100 de cazuri de tulburare au fost descrise intre 1996 si 2006 la nivel mondial [2]. Fenotipurile clinice despre 46, XX DSD au fost identificate la trei grupuri, inclusiv barbati cu fenotip normal, barbati cu ambiguitati genitale si barbati cu hermafrodite adevarate [3]. DSD ovotesticular, care se caracterizeaza prin prezenta atat a tesutului testicular, cat si a ovarului in gonadele aceluiasi individ, si a DSD testiculare, caracterizata printr-o dezvoltare completa a ambelor gonade ca testicuri, fara dovezi de tesut ovarian [4]. Aproximativ 80% dintre persoanele cu 46,

Gena regiunii determinanta de sex ( SRY ), localizata in cromozomul Y, joaca un rol major in codificarea unui factor determinant al testiculului (TDF) [6, 7]. Aproximativ 90% dintre acesti pacienti au material cromozomial Y incluzand gena SRY , care sunt de obicei translocati spre varful distal al bratului scurt al cromozomului X sau al cromozomilor autosomali. Aproximativ 10% 46, barbatii XX sunt negativi pentru gena SRY , care ar putea purta diferite grade de masculinizare [8, 9].

Exista mai multe mecanisme patogene care explica 46, XX pacienti cu testicul DSD: 1. translocarea secventelor Y, incluzand gena SRY , intr-un cromozom X sau la un autosom; 2. o mutatie intr-o gena din calea de determinare a testiculelor care declanseaza diferentierea testiculelor la barbatii negativi ai SRY XX; si 3. un mozaicism cromozom Y ascuns limitat la gonada [10].

Acest studiu a urmarit sa descrie cinci DSD de sex masculin 46, XX cu SRY- pozitiv, investigand caracteristicile clinice si relatiile lor cu cariotipul cromozomial si gena SRY .

Date participante si clinice

Am colectat 5 pacienti netratati cu SRY -pozitia 46, XX, care au fost referiti pentru infertilitate. Examenul fizic a inclus masurarea inaltimii, potentialul ginecomastie si inspectia organelor sexuale externe. Volumul bilateral a fost calculat ca suma volumului ambelor teste. Conform ghidurilor Organizatiei Mondiale a Sanatatii, analiza de sperma a fost indicata azoospermiei dupa centrifugarea ejaculatului.

Au fost evaluate nivelurile serice ale hormonului stimulator al foliculilor (FSH), hormonului luteinizant (LH), estradiol, prolactinei, testosteronului si testosteronului liber.

Toate procedurile utilizate in studiu au confirmat principiile Declaratiei de la Helsinki. Comitetul de etica al spitalului Jinling a aprobat protocoalele utilizate. Toti participantii au stiut sa participe la studiu. Toti participantii au obtinut consimtamantul scris in scris.

Analiza cariotipului de banda G in limfocite si hibridizare cu fluorescenta in situ (FISH)

Cariotipurile au fost efectuate pe limfocite din sangele periferic la cinci pacienti, inclusiv 100 de celule metafazice prin tehnici de operatie conventionale. Cromoza X, cromozomul Y si gena SRY au fost localizate folosind FISH cu sonde de centromere X cromozom, Y cromosom centromere (CEP X cu Spectrum Green, CEP Y cu Spectrum Orange, Vysis, Downers Grove, IL; articol nr.32-111051) si Gena SRY ( SRY cu Orange, Vysis, Downers Grove, IL; articol nr. 30-190079).

Analiza moleculara

A fost extras ADN-ul genomic din sangele periferic al pacientilor care folosesc QIAamp DNA Kits Blood. Cele trei regiuni discrete, AZFa, AZFb si AZFc, localizate pe bratul lung al cromozomului Y, au fost realizate prin amplificare PCRs multiplex (Polimeraza Chain Reaction). Setul de primeri PCR pentru diagnosticul microdeletiei regiunii AZFa, AZFb si AZFc au inclus: sY84, sY86, sY127, sY134, sY254, sY255, SRY si ZFX / ZFY.

Cei cinci pacienti ai nostri au avut o inaltime mai mica a corpului. Examinarea fizica a relevat faptul ca testiculele lor au un volum mic, au o textura moale si un penis normal. Nu s-au observat ginecomastii potentiale si hipospadii congenitale. Si toti au descris ca au o functie sexuala normala. Analizele semenului au aratat azoospermie. Datele endocrinologice au indicat ca pacientii aveau un nivel mai mare de FSH, LH, testosteron libera mai scazuta, nivel de testosteron si nivel normal de Estradiol, Prolactina. Caracteristicile generale si nivelurile de hormoni endocrini sunt prezentate in tabelul 1.

Analiza cariotipului la toti pacientii a confirmat 46, XX cariotip si analiza FISH a aratat ca gena SRY a fost pozitiva si translocata la Xp (Figura 1). Analiza moleculara a relevat faptul ca gena SRY a fost prezenta, iar regiunile AZFa, AZFb si AZFc au fost absente (Figura 2).

46, XX sindromul masculin este un sindrom de inversare a sexului rar caracterizat printr-un cariotip feminin in discordanta cu un fenotip masculin. 90% din 46, XX, DSD testiculare au de obicei o heterogenitate fenotipica masculina normala la nastere si sunt diagnosticati dupa pubertate pe ambiguitati genitale sau infertilitate [8]. Cercetarile noastre au raportat ca cinci pacienti au prezentat un cariotip feminin, dar au fost fenotipic barbati (46, XX barbati). Au avut genitale externe normale si masculinizare, dar au prezentat azoospermie. S-ar putea ca toti barbatii sa fie pozitivi cu SRY , care s-au translocat pe bratul scurt al cromozomului X, si absenta factorilor spermatogeni care codifica gena pe Yq, cum ar fi regiunea AZFa, AZFb si AZFc in cromozomul Y.

Gena SRY este localizata in cromozomul Y si codifica un domeniu al grupului de mare mobilitate (HMG), un motiv conservat prezent in multe proteine ​​care leaga ADN-ul, care ar putea regla diferentierea testiculelor [11, 12]. Proteina SRY este exprimata in creasta genitala inainte de formarea testiculelor, iar in testicul in perioada de formare a testiculelor la inceputul vietii fetale, pana la dezvoltarea testiculelor adulte [13]. Analiza geneticii moleculare a demonstrat ca majoritatea 46, XX pacienti testiculari cu DSD poarta gena SRY care s-a translocat la cromozomul X [14-16]. A existat un raport conform caruia un fragment de gena SRY s-a transferat de la cromozomul Y in cromozomul autosomal [17]. Unii pacienti au prezentat SRYnegativ, care a avut intotdeauna ambiguitati si ginecomastie genitale externe. In ciuda faptului ca gena SRY este considerata principalul factor de reglare pentru determinarea testiculelor, variabilitatea fenotipica a prezentat in 46, cazurile inversate de sex XX nu pot fi explicate doar daca este prezentata gena SRY . Si o serie de alte gene precum SOX9, DAX-1, WT1, WNT4, FGF9 si RSPO1 au fost implicate in procesul de diferentiere a gonadelor [8].

Fenotipul masculului XX observat la indivizii SRY pozitivi 46, XX variaza foarte mult, de la gonadele masculine interne si externe normale la caracteristici sexuale secundare anormale, testicule mici si hipospadii, la un adevarat hermafrodit. S-a sugerat ca variatia fenotipului depinde in primul rand de doua mecanisme: modelul de inactivare al cromozomilor X (XCI) si cantitatea de material Y incluzand gena SRY care a fost translocata in cromozomul X [18]. Analizand literatura de specialitate, 46, XX barbati cu hermafrodite adevarate sau ambiguitate gonadala au o portiune mica din materialul cromozomului Y translocat la X, care poate presupune raspandirea XCI si inactivarea genei SRY [19]. Se estimeaza ca un fenotip masculin normal va rezulta dintr-un Yp mai mareFragmentul portant SRY fiind translocat in cromozomul X, unde lungimea fragmentului Yp poate proteja gena SRY de la tacere prin raspandirea XCI [19]. In studiul nostru, toate cele cinci cazuri au organe genitale externe normale si masculinizare, ceea ce este de asteptat sa existe mai mult material cromozom Y pe X, probabil protejand gena SRY de raspandirea inactivarii. Din cauza indisponibilitatii din esantioane din cele cinci cazuri pentru a fi studiate in continuare, nu putem face mai multe analize moleculare pentru a confirma punctul de mai sus. Pana acum, atat modelele XCI aleatorii, cat si cele aleatoare, au fost raportate la 46 de barbati XX, cu un fenotip masculin normal [18, 20]. Este indicat faptul ca modelul XCI nu poate fi asociat cu fenotipul XX masculin.

Cu toate acestea, a fost raportat un alt mecanism, cunoscut sub numele de efectul de pozitie, pentru a explica diferentele fenotipice observate. Diferentele fenotipice depind de apropierea punctului de intrerupere de gena SRY , precum si de prezenta sau absenta rearanjarilor criptice care afecteaza expresia genei SRY [21]. Reorganizarile pot duce la o reprimare transcriptionala, probabil prin eliminarea elementelor reglatoare esentiale sau modificari ale structurii locale a cromatinei [22].

In plus, variabilitatea fenotipica poate fi asociata cu variatii ale polimorfismelor genetice si cu variatia numarului de copii ale genelor specifice pe cromozomul X, cum ar fi NROB1 si TAF7L [23, 24].

Masculii clasici 46, XX au un nivel normal de testosteron si un nivel liber de testosteron in perioada adolescentei, dar pot scadea la varsta adulta, ceea ce duce la hipogonadism hipergonadotropic [25]. Cazurile noastre au avut organe genitale normale si au fost diagnosticate pentru infertilitate dupa pubertate. Nivelul de testosteron si de testosteron liber este deficitar la cinci pacienti. In plus, se observa niveluri ridicate de FSH si LH. Acest lucru ar putea explica faptul ca, chiar daca barbatii 46, XX au o genitalitate externa normala si o masculinizare si ca sunt lipsiti de spermatogeneza.

Inaltimea corporala a pacientilor despre care am raportat era sub 169 cm (inaltimea medie a barbatului chinez) si apropiata de cea a femelelor normale. Exista unele asemanari fenotipice intre barbatii 46, XX si cei cu sindromul Klinefelter, dar barbatii 46, XX tind sa fie mai mici decat barbatii cu KS [9]. Kirsch si colab. a indicat ca gena de control al cresterii cromozomului Y ( GCY ) care, langa centromere, a avut un posibil impact asupra cresterii [26]. Si au existat cateva documente care indica faptul ca expresia genei SHOX (homeobox cu statura scurta) si SHOXregiunile de imbunatatire au jucat un rol in crestere [27]. S-a sugerat ca genele specifice de crestere ale cromozomului Y nu pot trece la pacienti, ceea ce le-ar putea face sa prezinte o statura feminina. Terapia cu GH (hormonul de crestere) poate avea unele efecte statuare in haploinsuficienta SHOX si poate fi insuficienta pentru a preveni dezvoltarea leziunilor scheletului dupa pubertate [28].

DSD:

Tulburarea dezvoltarii sexului

SRY :

Gena regiunii Y determinanta de sex

TDF:

factorul determinant al testiculelor

PESTE:

Hibridizare fluorescenta in situ

FSH:

Hormonul care stimuleaza foliculele

LH:

Hormonul luteinizant

PCR:

Reactia in lant a polimerazei

HMG:

Grup de mobilitate ridicata

SOX9 :

SRY (regiunea Y determinand sexul) – gena 9

Gena WT1 Wilms tumora 1:

WNT4:, familia site-ului de integrare MMTV de tip aripa , gena membru 4, FGF9 , gena factorului de crestere a fibroblastului 9

RSPO1 :

Gena R-spondin 1

GCY :

Gena de control al cresterii

SHOX :

Homeobox cu statura scurta

GH:

Hormon de crestere

XCI:

Inactivarea cromozomului X

KS:

Sindromul Klinefelter

NROB1 ( DAX-1 ):

Subfamilia de receptori nucleari 0, grupa B, gena membrului 1

TAF7L :

Gena RNA polimeraza asemanatoare TAF7.

Afilieri

1. Institutul de Medicina de Laborator, Spitalul Jinling, Scoala de Medicina a Universitatii Nanjing, 305 East Zhongshan Road, Nanjing, 210002, PR China
   • Qiu-Yue Wu
   • , Na Li
   • , Wei-Wei Li
   • , Tian-Fu Li
   • , Cui Zhang
   • , Ying-Xia Cui
   •  & Xin-Yi Xia
2. Departamentul de ingrijire a sanatatii, spitalul Jinling, Scoala de medicina a Universitatii Nanjing, Nanjing, 210002, PR China
   • Jin-Sheng Zhai

Autori corespondenti

Corespondenta la Xin-Yi Xia sau Jin-Sheng Zhai.

Interesele concurente

Autorii declara ca nu au interese concurente.

Contributiile autorilor

QW a efectuat studii genetice moleculare si a elaborat manuscrisul. NL, WL, TL si CZ au participat la lucrarile de laborator. YC, JZ si XX au conceput studiul si au participat la proiectarea si coordonarea acestuia si au ajutat la redactarea manuscrisului. Toti autorii au citit si au aprobat manuscrisul final.