Efectele dependente de varsta si sex ale metforminei asupra celulelor precursoare neuronale si de recuperare cognitiva intr-un model de AVC neonatal

Metformin are efecte dependente de varsta si sex asupra bazinului NSC din SVZ

Am efectuat o curba in vitro doza-raspuns cu celule derivate prin SVZ de la femei si barbati, atat de la soareci neonatali cat si adulti, folosind testul neurosferei, unde numarul total de neurosfere reflecta dimensiunea bazinului NSC (fig. S1, A la D). Culturi SVZ neonatale expuse la 1 μM metformina in vitro [Fig. 1, A (femei) si B (barbati)] si soareci tratati cu injectii zilnice de metformina din ziua postnatala 9 (P9) pana la P12 (in vivo) [Fig. 1, C (femei) si D (barbati)] au aratat o crestere semnificativa a formarii neurosferei la ambele sexe. In schimb, in ​​experimente separate efectuate la tineri, metformina nu a afectat dimensiunea bazinului NSC in vitro sau in vivo la femei [Fig. 1, A (in vitro) si C (in vivo)] sau barbati [Fig. 1, B (in vitro) si D (in vivo)]. La soarecii adulti tineri, expunerea la metformina a extins dimensiunea bazinului NSC la femei [Fig. 1, A (in vitro) si C (in vivo)], dar nu si barbatii [Fig. 1, B (in vitro) si D (in vivo)]. Pentru a stabili daca lipsa de expansiune la soarecii masculi adulti s-a datorat dozei sau duratei tratamentului cu metformina, am administrat metformina soarecilor masculi adulti folosind paradigma neonatala (20 mg / kg de metformina timp de 4 zile), unde barbatii au fost receptivi, precum si alte permutari ale dozei si duratei (20 mg / kg timp de 7 zile si 200 mg / kg timp de 4 zile). Am constatat ca doza si durata tratamentului cu metformina nu au avut niciun efect asupra numarului de neurosfere de la SVZ de sex masculin adult (fig. S2, A si B). Aceste descoperiri dezvaluie ca abilitatea metforminei de a extinde dimensiunea bazei NSC din SVZ depinde atat de sex, cat si de varsta. Pentru a stabili daca lipsa de expansiune la soarecii masculi adulti s-a datorat dozei sau duratei tratamentului cu metformina, am administrat metformina soarecilor masculi adulti folosind paradigma neonatala (20 mg / kg de metformina timp de 4 zile), unde barbatii au fost receptivi, precum si alte permutari ale dozei si duratei (20 mg / kg timp de 7 zile si 200 mg / kg timp de 4 zile). Am constatat ca doza si durata tratamentului cu metformina nu au avut niciun efect asupra numarului de neurosfere de la SVZ de sex masculin adult (fig. S2, A si B). Aceste descoperiri dezvaluie ca capacitatea metforminei de a extinde dimensiunea bazinului NSC din SVZ depinde atat de sex, cat si de varsta. Pentru a stabili daca lipsa de expansiune la soarecii masculi adulti s-a datorat dozei sau duratei tratamentului cu metformina, am administrat metformina soarecilor masculi adulti folosind paradigma neonatala (20 mg / kg de metformina timp de 4 zile), unde barbatii au fost receptivi, precum si alte permutari ale dozei si duratei (20 mg / kg timp de 7 zile si 200 mg / kg timp de 4 zile). Am constatat ca doza si durata tratamentului cu metformina nu au avut niciun efect asupra numarului de neurosfere de la SVZ de sex masculin adult (fig. S2, A si B). Aceste descoperiri dezvaluie ca abilitatea metforminei de a extinde dimensiunea bazei NSC din SVZ depinde atat de sex, cat si de varsta. precum si alte permutari ale dozei si duratei (20 mg / kg timp de 7 zile si 200 mg / kg timp de 4 zile). Am constatat ca doza si durata tratamentului cu metformina nu au avut niciun efect asupra numarului de neurosfere de la SVZ de sex masculin adult (fig. S2, A si B). Aceste descoperiri dezvaluie ca abilitatea metforminei de a extinde dimensiunea bazei NSC din SVZ depinde atat de sex, cat si de varsta. precum si alte permutari ale dozei si duratei (20 mg / kg timp de 7 zile si 200 mg / kg timp de 4 zile). Am constatat ca doza si durata tratamentului cu metformina nu au avut niciun efect asupra numarului de neurosfere de la SVZ de sex masculin adult (fig. S2, A si B). Aceste descoperiri dezvaluie ca abilitatea metforminei de a extinde dimensiunea bazei NSC din SVZ depinde atat de sex, cat si de varsta.

Fig. 1 Tratamentul cu metformin in vitro si in vivo duce la o expansiune dependenta de varsta si sex in bazinul NSC.

(A si B) Schimbare plina a numarului de neurosfere din SVZ de neonatale (P8), juvenile (P17) si adulte (7 saptamani) de sex feminin [(A) neonat: −Met, n = 16 soareci; + Met, n = 16 soareci; P <0,001; juvenil: −Met, n = 7 soareci; + Met, n = 7 soareci; adult: −Met, n = 15 soareci; + Met, n = 15 soareci; peste trei pana la sapte experimente independente pe grup de varsta, P <0,05; Elevul t test] si barbatii [(B) nou-nascuti: −Met, n = 15 soareci; + Met, n = 15 soareci; P <0,001; juvenil: −Met, n = 10 soareci; + Met, n= 10 soareci; adult: −Met, n = 11 soareci; + Met, n = 11 soareci; peste patru pana la cinci experimente independente pe grupa de varsta, testul t Student ] in urma administrarii in vitro a metforminei (1 μM). (C si D) Schimbare plina a numarului de neurosfere de la SVZ de neonatale (P8), tinere (P17) si adulte (7 saptamani) de sex feminin [(C) nou-nascut: −Met, n = 4 soareci; + Met, n = 5 soareci; P <0,05; juvenil: −Met, n = 9 soareci; + Met, n = 8 soareci; adult: −Met, n = 10 soareci; + Met, n = 8 soareci; P <0,05; peste trei-cinci experimente independente pe grup de varsta, Student’s ttest] si barbati [(D) nou-nascuti: −Met, n = 6 soareci; + Met, n = 6 soareci; P <0,05; juvenil: −Met, n = 6 soareci; + Met, n = 5 soareci; adult: −Met, n = 7 soareci; + Met, n = 5 soareci; peste trei-patru experimente independente pe grupa de varsta, testul Student t ] dupa administrarea in vivo cu vehicul sau metformina (20 sau 200 mg / kg). Experimentele de-a lungul diferitelor varste au fost analizate folosind testul t Student . * P <0,05, *** P <0,005, **** P <0,001. Met, metformina.

Marimea bazei NSC si capacitatea de reactie la hormonii sexuali sunt similare la barbati si femei, in absenta metforminei

Avand in vedere diferentele observate in functie de sex in raspunsul NSC-urilor la metformina, am emis ipoteza ca hormonii sexuali pot juca un rol in medierea raspunsului diferential dintre femei si barbati. In primul rand, am stabilit ca numarul de NSC-uri de la SVZ-uri potrivite de varsta de soareci de sex masculin si feminin a fost similar in conditii de baza (fig. S3, A pana la C). Mai mult, expunerea culturilor SVZ primare obtinute la adulti la estradiol sau testosteron (respectiv hormoni sexuali de sex feminin si masculin) nu a avut niciun efect asupra numarului de neurosfere de la soarecii adulti, fie de sex (fig. S4, A si B). Intrucat culturile primare contin celule de nisa, am intrebat ulterior daca populatiile pure de NSC (adica, celulele trecute din neurosfera, care indeparteaza efectiv nisa) au raspuns la hormonii sexuali. Neurosferele din culturile masculine si feminine au fost disociate si repliate in estradiol sau testosteron. Expunerea la estradiol a condus la o crestere semnificativa a numarului de neurosfere trecute de la ambele sexe (fig. S4C). Testosteronul nu a avut niciun efect asupra numarului de neurosfere trecute la niciun sex (fig. S4D). Impreuna, aceste descoperiri demonstreaza ca expansiunea diferentiala a bazinului NSC la barbatii si femelele adulte ca raspuns la metformina nu se datoreaza diferentelor de baza in dimensiunea bazei NSC sau efectelor hormonilor pe cont propriu.

Nisa expusa la estradiol este suficienta pentru ca metformina sa extinda bazinul NSC la femei

Pentru a testa daca expansiunea mediata de metformina a bazinului NSC depinde de hormoni, am administrat estradiol la soarecii tineri, la o varsta in care NSC-urile feminine nu raspund la metformina. Soarecii au primit tratament cu estradiol timp de 10 zile incepand cu P17 si metformin timp de 7 zile incepand cu P21 ( n = 8 pana la 9; Fig. 2A). Am observat o crestere semnificativa a numarului de neurosfere din SVZ la soarecii de sex feminin tineri tratate cu estradiol si metformina, dezvaluind ca estradiolul este suficient pentru a permite cresterea indusa de metformina in bazinul NSC, similar cu ceea ce se observa la soarecii de sex feminin adulti ( Fig. 2A). Intr-un experiment de pierdere a functiei, am efectuat testul neurosferei de la soarecii adulti de sex feminin care au fost ovariectomizati pe P28, eliminand eficient estradiolul circulant ( 27), si care a primit 7 zile de metformina incepand cu P50 (Fig. 2B). Dupa cum s-a prevazut, nu s-a observat nicio expansiune a bazinului NSC la soarecii ovariectomizati ca raspuns la administrarea de metformina (Fig. 2B). Impreuna, aceste descoperiri sustin ipoteza ca estradiolul este suficient pentru extinderea mediatizata de metformina a bazinului NSC.

Fig. 2 Estradiolul in nisa feminina este suficient pentru extinderea bazei NSC indusa de metformina.

(A) Paradigma experimentala si modificare a numarului de neurosfere de la SVZ de soareci tineri care au primit estradiol (5,6 mg / kg) sau vehicul timp de 11 zile si metformina (200 mg / kg) sau vehicul timp de 7 zile in vivo ( Est + vehicul, n = 9 soareci; Est + Met, n = 8 soareci; peste cinci experimente independente; P <0,05; testul t al studentului ). (B) Paradigma experimentala si modificare a numarului de neurosfere de la soarecii de control si ovariectomizati dupa administrarea vehiculului sau metforminei (200 mg / kg) timp de 1 saptamana in vivo (Ov + vehicul, n = 8 soareci; Ov + Est, n = 8 soareci; peste trei experimente independente; studentul tTest). (C) Schimbarea de mai multe ori a numarului de neurosfere trecute in prezenta sau absenta de 1 μM metformina in vitro (−Met, n = 7 soareci; + Met, n = 7 soareci; peste patru experimente; testul t al studentului ). * P <0,05. Est, estradiol; Met, metformina; Ov, ovariectomizat; ns, nesemnificative.

Extinderea bazinului NSC a fost observata in urma administrarii de metformina in vivo si in vitro in culturile SVZ primare de la soarecii de sex feminin in prezenta metforminei. Pentru a intreba daca nisa feminina este necesara pentru extinderea observata, am indepartat nisa prin placarea celulelor derivate ale neurosferei trecute in prezenta metforminei. In special, metformina nu a dus la o crestere a neurosferelor in absenta nisei (Fig. 2C), relevand ca metformina actioneaza prin nisa feminina pentru a media expansiunea bazinului NSC.

Testosteronul inhiba expansiunea indusa de metformina a bazinului NSC

Spre deosebire de ceea ce s-a observat la femelele juvenile, tratamentul cu estradiol si metformin nu a extins dimensiunea bazinului NSC la soarecii masculi tineri (Fig. 3A). O posibila explicatie este ca un mediu inhibitor la SVZ de sex masculin impiedica NSC-urile sa raspunda la metformina. Am intrebat daca testosteronul a fost suficient pentru a inhiba efectul metforminei asupra expansiunii NSC prin administrarea de testosteron, in prezenta sau absenta metforminei, la soarecii neonatali de ambele sexe de la P9 la P12, o varsta in care metformina extinde bazinul NSC la ambele sexe ( Fig. 1, C si D). Administrarea concomitenta a metforminei si testosteronului a dus la pierderea acestei expansiuni la barbati (Fig. 3B) si la femei (fig. S5). Am prezis ca daca testosteronul a fost inhibitor pentru efectul metforminei, administrarea metforminei la barbatii adulti castrati (care nu au testosteron) ar duce la o extindere a bazinului NSC. Am constatat ca o saptamana de administrare de metformina la soarecii de sex masculin castrati a dus la o crestere semnificativa de 1,2 ori a neurosferelor (Fig. 3C). Aceste descoperiri sustin ipoteza ca testosteronul inhiba expansiunea indusa de metformina a bazinului NSC.

Fig. 3 Testosteronul inhiba expansiunea indusa de metformina a bazinului de celule stem.

(A) Paradigma experimentala si modificare a numarului de neurosfere de la SVZ de soareci tineri barbati care au primit estradiol (5,6 mg / kg) sau vehicul timp de 11 zile si metformina (200 mg / kg) sau vehicul timp de 7 zile in vivo ( Vehicul Est +, n = 5 soareci; Est + Met, sapte soareci din trei pana la patru experimente independente, testul t al lui Student ). (B) Paradigma experimentala si schimbare a numarului de neurosfere de la soareci neonatali de sex masculin care au primit doar testosteron sau testosteron si metformina timp de 4 zile in vivo (Test + vehicul, n = 7 soareci; Test + Met, n = 7 soareci peste sapte experimente independente; Student’s tTest). (C) Paradigma experimentala si schimbare a numarului de neurosfere de la barbatii de control si castrati dupa administrarea vehiculului sau metforminei (200 mg / kg) timp de 1 saptamana in vivo (Cast + vehicul, n = 9 soareci; Cast + Met, n = 9 soareci; peste trei experimente independente; P <0.05; testul t al studentului ). (D) Schimbarea de mai multe ori a numarului de neurosfere trecute in prezenta sau absenta de 1 μM metformina in vitro (−Met, n = 7 soareci; + Met, n = 7 soareci; peste patru experimente; P <0,01; tTest). (E) cocultura paradigma si schimbarea ori a numarului de neurosferele din celulele masculine YFP placate intr – un mediu preponderent feminin, in prezenta sau absenta 1 pM metformin, in vitro ( n = 9 experimente independente, P <0,05, al lui Student t test de ). (F) Paradigma si cultura de modificare a numarului de neurosfere de la celulele YFP feminine plasate intr-un mediu coplesitor de mascul, in prezenta sau absenta de 1 μM metformina in vitro ( n = 8 experimente independente, P <0.05, testul t Student ). * P <0,05, ** P <0,01. Turnat, castrat; Est, estradiol; Met, metformina; Test, testosteron.

In mod similar experimentelor pasagere folosind celule derivate din neurosfera de la femei, am placat celule derivate din neurosfera trecute de la barbati (in absenta nisei) in prezenta metforminei. Am observat o crestere semnificativa de 1,3 ori a numarului de neurosfere trecute (Fig. 3D), dezvaluind ca NSC-urile derivate de barbati sunt capabile sa raspunda la metformina.

Am urmat apoi o serie de experimente de cultura celulara folosind disectii SVZ primare (care contin celule de nisa) de la soareci masculi si femei. Am facut prognoza puternica ca celulele derivate de sex masculin placate in prezenta metforminei si a unui mediu coplesitor de feminin ar duce la o crestere a numarului de neurosfere derivate de sex masculin (Fig. 3E). Pentru a distinge celulele de sexele opuse, am efectuat experimente de cultura folosind proteine ​​fluorescente galbene (YFP) – soareci pozitivi. Neurosferele de la soarecii YFP (barbati sau femei) au fost numarate dupa ce au fost plasate in mediul soarecilor de tip salbatic de sex opus. Am observat o crestere semnificativa a numarului de neurosfere derivate de sex masculin in prezenta metforminei intr-un mediu coplesitor de feminin. Invers,

Metformin are efecte dependente de sex asupra proliferarii, dar creste neurogeneza la ambele sexe

Studiile anterioare au aratat ca tratamentul cu metformina duce la o crestere a proliferarii in cadrul SVZ ( 5 ). Pe baza observatiilor noastre dependente de sex, am prezis ca vom observa un efect diferential al metforminei asupra proliferarii in SVZ intre femei si barbati. Femelele adulte si barbatii au primit metformina timp de 1 saptamana, iar celulele proliferente au fost etichetate cu bromodeoxiuridina (BrdU) timp de 2 zile inainte de perfuzie (Fig. 4A). Am observat o crestere semnificativa de 1,37 ori a numarului de celule BrdU + la femei (Fig. 4, B si C), dar nu si la barbati (Fig. 4, D si E). S-a dovedit ca metformina imbunatateste neurogeneza ( 5)), astfel incat am evaluat daca exista efecte dependente de sex ale metforminei asupra diferentierii. O saptamana de tratament cu metformina (Fig. 4F) a dus la cresterea numarului de celule Dcx + Ki67 + atat la femei (Fig. 4, G si H) cat si la barbati (Fig. 4, I si J), ceea ce sugereaza o neurogeneza crescuta. Aceste descoperiri sugereaza ca metformina este capabila sa promoveze neurogeneza la ambele sexe, indiferent de expansiunea in bazinul NSC.

Fig. 4 Metformina are efecte dependente de sex asupra proliferarii, dar imbunatateste neurogeneza atat la femei, cat si la barbati.

(A) Paradigma experimentala. (B) Numarul mediu de celule BrdU + in SVZ de femele adulte tratate cu vehicul sau Met (200 mg / kg) timp de 1 saptamana (Vehicul, n = 4 soareci; Met, n = 4 soareci; P <0,05; Testul t al studentului ). (C) Celule BrdU + (sageti) in SVZ de soareci femele tratate cu vehicul sau Met. (D) Numar mediu de celule BrdU + in SVZ de barbati adulti tratate cu vehicul sau Met (200 mg / kg) timp de 1 saptamana (Vehicul, n = 3 soareci; Met, n = 3 soareci; tTest). (E) Celule BrdU + (sageti) in SVZ de soareci masculi tratati cu vehicul sau Met. (F) Paradigma experimentala. (G) Numar mediu de celule Ki67 + Dcx + in SVZ de soareci de sex feminin care au primit Met (200 mg / kg) timp de 1 saptamana in vivo (Vehicul, n = 5 soareci; Met, n = 5 soareci; P <0,05; Testul t al studentului ). (H) Celule Ki67 + Dcx + (varfuri cu sageti) in SVZ de soareci femele tratate cu vehicul sau Met (I) Numar mediu de celule Ki67 + Dcx + in SVZ de soareci masculi care au primit Met (200 mg / kg) timp de 1 saptamana in vivo (Vehicul, n = 4 soareci; Met, n = 3 soareci; P <0,05; Studentul tTest). (J) Celule Ki67 + Dcx + (varfuri de sageata) in SVZ de soareci masculi tratati cu vehicul sau Met. * P <0,05. Bare de scara, 50 μm. CC, callosum corpus; Dcx, doublecortin; LV, ventricul lateral; Met, metformina; Vehicul, vehicul.

Tratamentul cu metformina in urma HI salveaza deficientele cognitive la femeile adulte

Tratamentul cu metformina promoveaza recuperarea functiei motorii in urma leziunii HI neonatale ( 6 ). Pentru a determina daca efectele dependente de sex ale metforminei asupra populatiei NPC afecteaza in mod diferit recuperarea functionala, am evaluat functia cognitiva, care este afectata la soarecii adulti in urma insultelor HI neonatale ( 28 , 29). In urma HI, atat barbatii, cat si femeile au demonstrat o deficienta semnificativa in studiul 8 al sarcinii casetei puzzle, cu o latenta crescuta pentru a finaliza studiul (Fig. 5, A pana la C); acest lucru reflecta un deficit in achizitionarea unei noi sarcini (scoaterea dopului de carton pentru a accesa caseta de obiectiv). Cinci saptamani de tratament cu metformina, incepand cu 1 zi dupa accidentare si extinderea la varsta adulta, au dus la o imbunatatire semnificativa a studiului 8 la femei (Fig. 5B). In schimb, barbatii care au primit metformina nu au prezentat nicio imbunatatire semnificativa in comparatie cu animalele ranite cu HI (Fig. 5C). In plus, femeile ranite cu HI au avut o rata de trecere usor mai mare decat barbatii (61,5% fata de 45,5%, respectiv), rata de trecere a femeilor este chiar mai mare si mai asemanatoare cu controalele la femelele care au primit metformina in comparatie cu barbatii (fig. S6, E si F; HI + femele met, 80%; HI + barbati Met, 46,2%). Soarecii care au reusit sa invete sarcina in procesul 8 au reusit sa finalizeze studiul 9 la fel de repede ca si controalele (fig. S6, A si B), ceea ce sugereaza ca o deficienta motorie nu tine cont de cresterea latentei la procesul 8 la HI-ranit animale. Folosind sarcina defectelor piciorului, am demonstrat ca la 5 saptamani dupa HI, animalele ranite nu au prezentat un deficit semnificativ in functionarea motorului (fig. S6, C si D). Aceste rezultate sugereaza ca efectele sex-dependente ale metforminei asupra populatiei NPC pot juca un rol in recuperarea functionala in urma leziunii. am demonstrat ca la 5 saptamani dupa HI, animalele ranite nu au prezentat un deficit semnificativ in functionarea motorie (fig. S6, C si D). Aceste rezultate sugereaza ca efectele sex-dependente ale metforminei asupra populatiei NPC pot juca un rol in recuperarea functionala in urma leziunii. am demonstrat ca la 5 saptamani dupa HI, animalele ranite nu au prezentat un deficit semnificativ in functionarea motorie (fig. S6, C si D). Aceste rezultate sugereaza ca efectele sex-dependente ale metforminei asupra populatiei NPC pot juca un rol in recuperarea functionala in urma leziunii.

Fig. 5 Tratamentul pe termen lung cu metformin duce la imbunatatiri cognitive la femei, dar nu si la barbati, in urma leziunii precoce HI postnatal.

(A) Paradigma experimentala. (B) Timpurile de incercare in sarcina casetei puzzle-ului pentru soarecii de sex feminin care compara naiv (neinjurati), HI raniti si cohorte tratate cu H-I + metformina (Naive, n = 11 soareci; HI, n = 13 soareci; HI + Met, n = 15 soareci; * P <0,05, ** P <0,01, F 8,288 = 31,73) ANOVA cu doua cai cu masuri repetate). (C) Timpurile de incercare in sarcina casetei de puzzle pentru soareci masculi care compara naivi (neinjurati), HI raniti si HI + cohorte tratate cu metformina, care a dus la un efect de incercare (Naive, n = 8 soareci; HI, n = 11 soareci ; HI + Met, n = 13 soareci; * P <0,05, ** P <0,01, F8.232 = 32,93 ANOVA cu doua cai cu masuri repetate). * P <0,05, ** P <0,01. Met, metformina.

animale

Toate experimentele au fost efectuate in conformitate cu ghidurile institutionale aprobate de Comitetul pentru ingrijirea animalelor de la Universitatea din Toronto. Soarecii C57Bl / 6 au fost achizitionati de la laboratorul Charles River (Montreal, QC) sau crescuti in casa. Soarecii castrati si ovariectomizati au fost achizitionati din laboratorul Jackson (Maine, SUA). Soarecii Rosa-YFP folositi pentru experimentele de cultura au fost crescuti in casa. Dupa intarcare, soarecii au fost adapostiti intr-un ciclu lumina / intuneric de 12 ore, iar hrana si apa au fost furnizate ad libitum. De-a lungul acestor experimente, soarecii neonatali au fost definiti ca P8 pana la P12, soarecii tineri au fost P17 pana la P28, iar adultii aveau varsta de peste 6 saptamani.

Interventiile chirurgicale

Lezarea HI a fost efectuata asa cum s-a descris anterior ( 6 ). Pe scurt, soarecii P8 au fost anesteziati cu izofluran, iar artera carotida comuna stanga a fost legata permanent cu suturi de matase 6-0 si apoi transectata. Soarecii au fost inapoiati in cusca lor de acasa pentru a se recupera timp de 1,5 ore. Ulterior, soarecii au fost plasati intr-o camera hipoxica (8% oxigen) timp de 1 ora, in timp ce temperatura corpului a fost mentinuta la 37 ° C folosind un tampon de incalzire. Chirurgiile de castrare si ovariectomie au fost efectuate de laboratorul Jackson la P28 inainte de sosire.

Administrarea de medicamente

Pentru experimentele in vitro, s-a preparat o solutie stoc proaspata de metformina (1,1-dimetilbiguanura clorhidrat; Sigma-Aldrich, Oakville Ontario) (0,167 mg / ml) in mediu fara ser (SFM), continand 10X mediu modificat de Dulbecco Eagle / F12, 30% glucoza, 7,5% NaHCO3, 1 M Hepes, l-glutamina, amestec de hormoni si penicilina si streptomicina. Au fost realizate dilutii in SFM pentru a atinge concentratia finala dorita. Pentru experimente in vivo, metformina a fost preparata zilnic in solutie salina sterila tamponata cu fosfat 1X (PBS). Pentru experimentele efectuate pe animale de preincalzire nationala precoce postnatala, soarecii au primit injectii subcutanate de metformina (20 mg / kg) o data pe zi de la P9 la P12. La tineri si adulti tineri, soarecii au primit injectii intraperitoneale de metformina (200 mg / kg) o data pe zi de la P21 la P27 si, respectiv, de la P50 la P56. La investigarea dozei ideale de metformina la barbati, soarecii au primit 20 sau 200 mg / kg de metformina prin injectii intraperitoneale timp de 4 sau 7 zile. Pentru experimentele care investigheaza efectele hormonilor, estradiolul (5,6 mg / kg, Sigma-Aldrich, Missouri, SUA) sau vehiculul (ulei de susan, Sigma-Aldrich, Missouri, SUA) a fost administrat subcutanat de la P17 la P27, impreuna cu metformina intraperitoneala concurenta. (200 mg / kg) sau injectii cu PBS de la P21 la P27, asa cum am mentionat mai sus. Pentru administrarea de testosteron, s-a injectat subcutanat propionat de testosteron (100 μg, Toronto Research Chemicals, Ontario, Canada) sau vehicul (ulei de susan), impreuna cu injectii intraperitoneale concomitente de metformina (20 mg / kg) sau PBS. Pentru a investiga efectul tratamentului cu metformina post-HI,

Tratament si colorare BrdU

BrdU (65 mg / kg, Sigma-Aldrich, Missouri, SUA) a fost administrat prin injectare intraperitoneala o data pe zi pe P56 si P57. La o ora dupa ultima injectie, soarecii au fost anesteziati cu 250 mg / kg tribromoetanol (Sigma-Aldrich, Missouri, SUA) si apoi s-au perfuzat transcardial cu 1 PBS rece, urmata de 4% paraformaldehida (PFA; Sigma-Aldrich, Missouri, SUA). Creierele au fost extrase si transferate la 4% PFA la postfix timp de 1 ora si apoi depozitate la 4 ° C in zahroza 20% pentru crioprotectie. Creierele au fost criozecate (sectiuni de 20 μm) pe lamele de super-inghet (Fisher Scientific, Pennsylvania, SUA) si au fost mentinute la 4 ° C pana la colorare.

Sloturile au fost decongelate timp de 10 minute la temperatura camerei si rehidratate cu 1X PBS urmate de permeabilizare cu 0,03% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, Missouri, SUA). Diapozitivele au fost incubate in HCl 1 N la 65 ° C timp de 30 min si apoi in ser normal de magar 10% (NDS; Sigma-Aldrich, Missouri, SUA) timp de 1 ora la temperatura camerei. Apoi, diapozitivele au fost incubate cu anticorp BrdU de sobolan primar (1: 100, Abcam, Cambridge, Marea Britanie) peste noapte, urmate de un magar anticorp secundar Alexa Fluor 488 anti-sobolan (1: 400, Invitrogen, Oregon, SUA) timp de 2 ore la 37 ° C si apoi se acopera cu suport de montaj Vectamount (Vector, California). Cuantificarea s-a efectuat la marirea × 20 prin numararea unei sectiuni la fiecare 200 μm care incepe la trecerea corpului callosum si se incheie la aparitia comisurii anterioare. Aproximativ patru-sase sectiuni au fost numarate pe creier. Celulele BrdU + au fost numarate pe un microscop Zeiss (Axiovert 200 M, Zeiss, Germania).

imunohistochimie

Colorarea Dcx / Ki67. Slides were thawed for 10 min at room temperature then rehydrated with 1X PBS. Antigen retrieval was performed by incubating the slides in citrate buffer at 95°C for 15 min. Slides were cooled to room temperature before incubation with 5% NDS in 0.03% Triton X-100 for 1 hour at room temperature and then incubated with goat anti-Ki67 (1:500, Abcam, Cambridge, UK) and mouse anti-doublecortin (Dcx) (1:200, Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA) antibodies in 5% NDS in 0.03% Triton X-100 at 4°C overnight. Slides were incubated in secondary antibodies (donkey anti-goat Alexa Fluor 488 and donkey anti-mouse Alexa Fluor 568; 1:400 in PBS, Invitrogen, Oregon, USA) for 1.5 hours at room temperature and then incubated with DAPI (1:10,000, Invitrogen, Oregon, USA) for 10 min. Slides were coverslipped using Vectamount mounting media (Vector, California). Sections were imaged every 200 μm beginning at the crossing of the corpus callosum and ending at the appearance of the anterior commissure. Approximately four to five sections were imaged per brain at a ×20 magnification.

Analiza neurosferei

Pentru experimente in vivo, tesutul creierului a fost colectat in ziua ultimei injectii sau la 1 zi dupa ultima injectie a vehiculului sau metformina. Soarecii au fost anesteziati cu izofluran (Fresenius Kabi, Ontario, Canada) si eutanasiati prin luxatii cervicale. Creierele au fost indepartate si NPC-urile au fost izolate de la SVZ de soareci la diferite varste, asa cum s-a descris anterior ( 6 , 40). In urma microdisectiei SVZ, celulele au fost incubate intr-o solutie enzimatica [care contine trypsina (1,3 mg / ml), hialuronidaza (0,76 mg / ml), acid kinurenic (0,12 mg / ml); Sigma-Aldrich, Missouri, SUA] timp de 30 min la 37 ° C si apoi centrifugat la 1500 de rotatii pe minut (RPM) timp de 5 minute. Celulele au fost resuspendate intr-o solutie de inhibitor de tripsina (0,67 mg / ml; Worthington Biochemical Corporation, New Jersey, SUA) si s-au triturat, apoi s-au centrifugat la 1500 RPM timp de 5 minute. Celulele au fost resuspendate in SFM, triturate de cinci ori, centrifugate la 1500 RPM timp de 3 minute, resuspendate in 1 ml de SFM si apoi contate pe un hemocitometru. Celulele au fost placate la densitate clonala (10 celule / µl) ( 41) in prezenta factorului de crestere a fibroblastului (20 ng / ml, Gibco, New York, SUA), factor de crestere a epidermei (20 ng / ml, PeproTech, Quebec, Canada) si heparina (2 μg / ml, Sigma-Aldrich, Missouri, SUA) in SFM (neurosfera media) timp de 7 zile in prezenta sau absenta metforminei si numarul neurosferelor a fost numarat. Pentru experimente cu soareci postnatal timpurii, celulele au fost placate cu 5 celule / µl. Pentru trecere, neurosferele au fost colectate, disociate intr-o singura suspensie celulara si repliate la 2,5 celule / µl in mediile neurosferei timp de 7 zile. Pentru experimentele de cultura, celulele YFP primare au fost plasate la 1 celula / µl ca martor si au fost cultivate cu 9 celule / µl din C57Bl / 6 soareci de sex opus.

Testele comportamentale

Sarcina casetei de puzzle a fost efectuata la 7 saptamani dupa accidentare, asa cum s-a descris anterior ( 37 , 42 ). Sarcina evalueaza diverse domenii ale functiei cognitive, inclusiv memoria pe termen scurt si lung si rezolvarea problemelor. Pe scurt, soarecii au fost aclimatizati la camera de testare comportamentala luminos timp de 10 minute in fiecare din cele trei zile de testare consecutive. In fiecare zi, soarecii au efectuat trei incercari ( 37)). Pentru fiecare incercare, soarecii au fost plasati in caseta de pornire luminos si au fost obligati sa rezolve sarcini cu dificultati crescande pentru a intra intr-o caseta intunecata. Incercarile din prima zi au servit drept studii de obisnuinta. La proba 1, pasajul de la poarta a fost clar si a fost deschisa o usa deschisa catre poarta. La incercarile 2 si 3, pasajul era clar, dar nu mai era o usa; prin urmare, soarecii au fost nevoiti sa treaca sub despartire si prin pasaj subteran pentru a intra in caseta de gol. Acest lucru s-a repetat a doua zi in procesul 4. Incercarea 5 a necesitat soareci sa sape prin asternutul din pasaj, iar acest lucru a fost repetat pentru procesul 6 si din nou a doua zi pentru procesul 7. La proba 8, soarecii au fost introdusi intr-un dop de carton care li s-a cerut sa scoata din pasaj pentru a intra in caseta de obiectiv. Acest lucru a fost repetat pentru procesul 9. Toate incercarile au fost marcate complet dupa ce labele posterioare ale animalului au intrat in poarta sau dupa maxim 7 min. Soarecii au fost exclusi din studiu daca le-a fost nevoie de mai mult de 3,5 min pentru a finaliza oricare dintre studiile de obisnuire in prima zi.

Sarcina defectelor la picior a fost efectuata la 5 saptamani dupa accidentare pentru a evalua functia motorului. Soarecii au fost aclimatizati in sala de comportament timp de 10 min inainte de testare. Soarecii au fost asezati pe o grila de sarma inchisa si au fost liberi sa exploreze timp de 3 minute. Un observator orbit a urmarit testele inregistrate si a notat soarecii in functie de numarul de ori in care forepele lor au alunecat prin reteaua de sarma. Procentul de diferenta de eroare a fost calculat ca numarul de alunecari pe pasi totale cu laba dreapta minus numarul de alunecari / trepte totale cu laba stanga inmultit cu 100.

Statistici

All data were analyzed using GraphPad Prism version 6 software. For comparisons of the two groups, an unpaired Student’s t test was used (Figs. 1 to 4). For grouped analyses in Fig. 5, a multiple comparisons test after two-way repeated-measures analysis of variance (ANOVA) with post hoc Tukey’s correction was performed. A multiple comparisons test after one-way ANOVA with post hoc Tukey’s correction was performed in figs. S1 and S2. A multiple comparisons test after two-way repeated-measures ANOVA with post hoc Tukey’s correction was used for figs. S4 and S6. A Student’s t test was used for figs. S3 and S5. A P value less than 0.05 was considered statistically significant.

Materialul suplimentar pentru acest articol este disponibil pe http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/5/9/eaax1912/DC1

Fig. S1. Metformina la 1 μM creste numarul neurosferelor in functie de varsta si sex.

Fig. S2. Metformin nu are efect asupra numarului de neurosfere de la SVZ masculin adult, indiferent de doza de metformina sau de durata tratamentului.

Fig. S3. Numarul absolut de neurosfere este acelasi la soarecii C57 de sex masculin si feminin la fiecare varsta examinata.

Fig. S4. Lipsa efectelor sexuale dependente ale estradiolului si testosteronului asupra neurosferelor primare si secundare de la SVZ la soarecii adulti de sex feminin si masculin.

Fig. S5. Testosteronul si metformina elimina efectul metforminei asupra NPC-urilor la SVZ de sex feminin.

Fig. S6. Deficientele motorii nu tin cont de deficientele in achizitia sarcinilor la femei si barbati.